Wykorzystanie metody elektronowego rezonansu paramagnetycznego w badaniu stresu oksydacyjnego pszenicy

Abstract

Reaktywne formy tlenu wytwarzane są w komórkach roślinnych podczas naturalnych procesów fotosyntezy i oddychania. W warunkach stresowych, zaburzenie procesu fotosyntezy prowadzi do nadmiernego generowania RFT. Są one wówczas dezaktywowane przez enzymatyczne i/lub nieenzymatyczne antyoksydanty. Jednak mechanizm „unieczynnienia” reaktywnych form tlenu oraz czynniki decydujące o zwiększonej i/lub zmniejszonej tolerancji na stres nie są w pełni poznane. Celem niniejszej pracy było wykazanie, czy lokalizacja elektronów na cząsteczkach organicznych i wytwarzanie tzw. „długo-żyjących” rodników, może stanowić jeden z etapów ochrony komórek przed RFT w warunkach stresu selenowego. Materiał roślinny stanowiły trzy odmiany pszenicy różniące się tolerancją na stresy środowiskowe: wrażliwy „Manu” oraz bardziej odporne „Parabola” i „Kamila”. Hodowlę (14 dni) prowadzono w kulturach wodnych zawierających zestaw makro- i mikroelementów wg. Hoaglanda (kontrola) oraz po 2-dniowym wzroście na pożywkach, do których wprowadzano dodatkowo 100 μm selenu (Na2Se04). Efekty działania stresu selenowego badano poprzez określenie wzrost peroksydacji lipidów (stężenie MDA) oraz zmiany parametrów fluorescencji chlorofilu a. Stymulację mechanizmów obronnych określano analizując aktywację enzymów antyoksydacyjnych (SOD, CAT, POX) oraz stężenie nioskocząsteczkowych kwasu askorbinowego i glutationu. Obecność „długo-żyjących” rodników oraz jonów metali paramagnetycznych: Fe, Cu, Mn rejestrowano techniką elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR) w zakresie pola magnetycznego 200 - 500 mT oraz w wąskim zakresie 5 mT. Stres selenowy wywołał największy wzrost peroksydacji lipidów oraz obniżenie parametrów fluorescencji chlorofilu u pszenicy Manu, co potwierdza jej większą wrażliwość na stres w porównaniu do odmian Parabola i Kamila. Niższy poziom stresu selenowego, obserwowany w siewkach pszenicy Parabola Kamila był przypuszczalnie efektem aktywacji enzymów antyoksydacyjnych (dysmutaz i peroksydaz). Natomiast zwiększenie syntezy kwasu askorbinowego, glutationu oraz węglowodanów wykazano u wszystkich badanych odmian. Rejestracja widm techniką elektronowego rezonansu paramagnetycznego wykazała obecność centrów paramagnetycznych w postaci jonów metali grupy d, głównie manganu oraz występowanie „długo-żyjących” rodników zlokalizowanych na cząsteczkach chlorofilu a, w układzie semichinon - chinon, a także związanych z węglowodanami. Sugeruje się, iż u odmian o mniejszej tolerancji na stres (wykazujących mniejszą aktywację enzymów antyoksydacyjnych), „długo-żyjące” rodniki lokalizowane na cząsteczkach węglowodanów, mogą stanowić alternatywny mechanizm „obrony” komórek.

Reactive oxygen species are produced in plant cells during biological processes of photosynthesis and respiration. Under stressful conditions, inhibited photosynthesis process leads to excessive generation of ROS. These radicals are deactivated by enzymatic and/or non-enzymatic antioxidants. However, the mechanism of “inactivation” reactive oxygen species and the factors of increased and/or decreased stress tolerance are not fully understood.

The aim of the present study was to determine whether the location of electrons in the organic molecules and the production of so-called “long-lived” radicals may be one of the stages of cells protection against RFT under selenium stress conditions . The plant material consisted of three wheat varieties differing in tolerance to environmental stresses: sensitive “Manu” and more resistant “Parabola” and “Kamila”. Seeds were cultured (14 days) in Hoagland nutrient solution (control) and after two - day growth on media containing selenium at a concentration 100 μm (Na2Se04) in half-strength Hoagland nutrient. The effects of selenium stress was investigated by determining the increase of lipid peroxidation (MDA concentration) and the change of chlorophyll a fluorescence parameters. Activation of defenses system was indicated by analyzing the activation of the antioxidants enzymes (SOD, CAT, POX) and the concentration of the low molecular weight hydrophilic antioxidants ascorbic acid (ASA) and glutathione (GSH). The presence of “long - lived” radicals and paramagnetic metal ions: Fe , Cu, Mn was registered on electron paramagnetic resonance (EPR) in the magnetic field range of 200-500 mT and a narrow range of 5 mT . Selenium treatment caused increase of lipid peroxidation and decrease of chlorophyll fluorescence parameters especially in Manu wheat. This fact confirms its greater sensitivity to stress as compared to the varieties of Parabola and Kamila. Lower levels of selenium stress, observed in wheat seedlings Parabola and Kamila was probably caused by activation of antioxidant enzymes (superoxide dismutase and peroxidases). However, increase of the synthesis of ascorbic acid, glutathione and carbohydrates has been shown in all investigated wheat varieties. The registration of the spectra by electron paramagnetic resonance technique showed the presence of paramagnetic centers in the form of metal ions of group D, of manganese primarily and “long-lived" radicals located on chlorophyll molecules in the system semichinon - quinone and also associated with carbohydrates. It is suggested that in the varieties with less stress tolerance (exhibiting a lower antioxidant enzyme activation), “long-lived” radicals localized on carbohydrate molecules may be an alternative mechanism of “defense” cells.