Wpływ aminokwasów pobudzających na aktywność acetylocholinoesterazy i na okołodobową rytmikę aktywności lokomotorycznej myszy

Abstract

Aminokwasy pobudzające, niezależnie od swej ważnej roli fizjologicznej w ośrodkowym układzie nerwowym ssaków, mogą w pewnych okolicznościach wywoływać również zmiany neurodegeneracyjne. Wykazują one szczególne powinowactwo do neuronów cholinergicznych. W podjętych badaniach dokonano analizy wpływu agonistów i antagonistów receptorów glutaminianergicznych oraz antagonistów muskarynowych i nikotynowych receptorów cholinergicznych na aktywność AChE (markerowego enzymu układu cholinergicznego) w mózgu, mięśniu szkieletowym uda (musculus quadriceps femoris), mięśniu sercowym i mięśniu gładkim jelita cienkiego myszy, a także rejestrowano okołodobową aktywność lokomotoryczną u tych zwierząt. Ogółem badania przeprowadzono na 909 czteromiesięcznych samcach myszy białej szczepu Swiss, pochodzących z chowu wsobnego, o średniej masie ciała 27 g. Zwierzęta te hodowano w odpowiednich klatkach z wolnym dostępem do standardowej paszy i wody w jednakowych warunkach pod względem oświetlenia LD 12:12. Pierwszy eksperyment, dotyczył oznaczania aktywności AChE w mózgu oraz mięśniach. Badania przeprowadzono w 6 grupach kontrolnych i w 16 grupach doświadczalnych na 850 myszach. Łącznie wykonano 3400 oznaczeń aktywności AChE w mózgu i badanych mięśniach. W drugim eksperymencie, związanym z określeniem okołodobowej aktywności lokomotorycznej, badania wykonano w 8 grupach doświadczalnych na 59 osobnikach. W przypadku oznaczania aktywności AChE w mózgu, mięśniu szkieletowym uda, mięśniu sercowym i mięśniu gładkim jelita cienkiego myszy 6 grup kontrolnych otrzymywało zawsze o godzinie 8:00 0,9% roztwór NaCl w postaci iniekcji domięśniowej. Wszystkim zwierzętom poszczególnych 16 grup doświadczalnych zawsze o tej samej porze, tj. o godzinie 8:00, podawano ogólnoustrojowo (podskórnie względnie domięśniowo) w odpowiednich dawkach: kwas L-glutaminowy, L-glutaminian sodu, siarczan atropiny (celem zablokowania muskarynowych receptorów cholinergicznych), chlorek heksametoniowy (dla zablokowania nikotynowych receptorów cholinergicznych), siarczan atropiny łącznie z chlorkiem heksametoniowym (w celu kompleksowego zablokowania zarówno muskarynowych jak i nikotynowych receptorów cholinergicznych). Ponadto myszy otrzymywały siarczan atropiny, a po upływie 1 i 2 godzin dodatkowo L-glutaminian sodu, chlorek heksametoniowy, a po 1 i 2 godzinach dodatkowo L-glutaminian sodu, siarczan atropiny łącznie z chlorkiem heksametoniowym, a po upływie 1 i 2 godzin dodatkowo L-glutaminian sodu. Aktywność AChE oznaczano także po iniekcji samego kwasu N-metylo-D-asparaginowego, jak również po podaniu siarczanu atropiny i po upływie 1 i 2 godzin dodatkowo kwasu N-metylo-D-asparaginowego, chlorku heksametoniowego, a po 1 i 2 godzinach dodatkowo kwasu N-metylo-D-asparaginowego, siarczanu atropiny równocześnie z chlorkiem heksametoniowym, a po upływie 1 i 2 godzin dodatkowo kwasu N-metylo-D-asparaginowego. Ponadto aktywność AChE określano również w mózgu i mięśniach myszy, które otrzymywały tylko sam kwas DL-(E)-2-amino-4-metylo-5-fosfono-3-pentanowy (kompetycyjny antagonista receptorów NMDA) oraz kwas DL-(E)-2-amino-4-metylo-5-fosfono-3-pentanowy i dodatkowo po 1 godzinie kwas N-metylo-D-asparaginowy, sam kwas γ-D-glutamyloaminometylosulfonowy (antagonista receptorów nie-NMDA), a także kwas γ-D-glutamyloaminometylosulfonowy i po upływie 1 godziny dodatkowo kwas kainowy. Po zakończeniu eksperymentu myszy odpowiednich grup kontrolnych jak również doświadczalnych usypiano, wprowadzając je w stan głębokiej narkozy, podając im dootrzewnowe vetbutal w dawce 35 mg/kg m.c., po czym preparowano mózgowie, mięsień szkieletowy uda, mięsień sercowy i mięsień gładki jelita cienkiego. W supematantach homogenatów z mózgu i badanych mięśni oznaczano aktywność AChE kolorymetryczną metodą Ellmana i wsp. (1961), w której jako substratu używano jodku acetylotiocholiny. Aktywność badanego enzymu wyrażano w pM jodku acetylotiocholiny (ATCh/g.h(-1)). W przypadku przeprowadzonych badań, które związane były z oceną okołodobowej aktywności lokomotorycznej myszy, zwierzętom odpowiednich grup doświadczalnych podawano zawsze o godzinie 12:00 przez trzy dni: siarczan atropiny, chlorek heksametoniowy, siarczan atropiny równocześnie z chlorkiem heksametoniowym, L-glutaminian sodu, kwas N-metylo-D-asparaginowy, kwas DL-(E)-2-amino-4-metylo-5-fosfono-3-pentanowy, kwas kainowy i kwas γ-D-glutamyloaminometylosulfonowy. Okołodobową aktywność lokomotoryczną myszy określano metodą bieżni kołowej za pomocą komputerowego zestawu aparatury do ciągłej rejestracji aktywności lokomotorycznej zwierząt w warunkach LD 12:12. W tym celu myszy odpowiedniej serii doświadczalnej umieszczano pojedynczo w oddzielnych klatkach z bieżnią kołową. Wszystkie dane dla poszczególnych osobników w danej serii doświadczalnej zbierane były przez cały okres trwania eksperymentu (około 20 dni), co 10 minut przez każdą dobę. Uzyskane dane przy zastosowaniu specjalistycznego programu komputerowego „CHRONOS” (Domosławski 1993) były przedstawione następnie w postaci komputerowej analizy aktogramów oraz analizy Fouriera. Jeśli chodzi o analizę Fouriera to przedstawiono ją dla poszczególnych myszy danej serii doświadczalnej w postaci trzech oddzielnych wykresów, które odnoszą się do: kilkudniowego okresu poprzedzającego rozpoczęcie iniekcji określonej substancji, następnie trzech kolejnych dni związanych z jej podaniem oraz po upływie kilku dni od momentu zakończenia tych iniekcji. Na podstawie przeprowadzonych badań stwierdzono, że zastosowane związki należące z jednej strony do agonistów z drugiej zaś do antagonistów receptorów glutaminianergicznych oraz antagonistów muskarynowych i nikotynowych receptorów cholinergicznych w istotny sposób wpływają zarówno na aktywność AChE w mózgu, mięśniu szkieletowym uda, mięśniu sercowym i mięśniu gładkim jelita cienkiego, a także na okołodobową aktywność lokomotoryczną myszy. Po jednorazowym podskórnym podaniu kwasu glutaminowego jak również kwasu N-metylo-D-asparaginowego generalnie w większości analizowanych przedziałach czasowych od momentu iniekcji tych substancji zanotowano istotne obniżenie aktywności AChE zarówno w mózgu jak i badanych mięśniach. Natomiast po iniekcji L-glutaminianu sodu wykazano statystycznie znamienny wzrost aktywności AChE w mózgu i mięśniach. W przypadku zastosowanych antagonistów receptorów glutaminianergicznych, a mianowicie kwasu DL-(E)-2-amino-4-metylo-5-fosfono-3-pentanowego (kompetycyjny antagonista receptorów NMDA), a także kwasu γ-D-glutamyloaminometylosulfenowego (antagonista receptorów nie-NMDA) stwierdzono wyraźne obniżenie aktywności AChE w mózgu, mięśniu szkieletowym uda, mięśniu sercowym i mięśniu gładkim jelita cienkiego. W przeprowadzonych badaniach stwierdzono także istotne obniżenie aktywności AChE w większości przedziałów czasowych w mózgu i badanych mięśni po iniekcji siarczanu atropiny, który jest antagonistą muskarynowych receptorów cholinergicznych. Z kolei domięśniowe podanie chlorku heksametoniowego i zablokowanie nikotynowych receptorów cholinergicznych spowodowało istotny wzrost aktywności AChE po 1, 2 i 3 godzinach od czasu iniekcji w mózgu, mięśniu szkieletowym uda i mięśniu sercowym, natomiast znamienne obniżenie aktywności tego enzymu po 4 i 5 godzinach w mózgu, mięśniu szkieletowym uda, mięśniu sercowym i po 1, 2 i 6 godzinach w mięśniu gładkim jelita cienkiego. Po kompleksowym zablokowaniu muskarynowych i nikotynowych receptorów cholinergicznych przez łączne domięśniowe podanie siarczanu atropiny i chlorku heksametoniowego zanotowano statystycznie znamienny wzrost aktywności AChE w mózgu tylko po 3 godzinach, natomiast w mięśniu szkieletowym uda po 1, 2, 4 i 5 godzinach i w mięśniu sercowym po 1, 3 i 5 godzinach. Obniżenie zaś aktywności tego enzymu miało miejsce w mózgu po 4 i 5 godzinach oraz w mięśniu gładkim jelita cienkiego po 1, 2, 4 i 5 godzinach. Istotne zmiany aktywności AChE wykazano również w mózgu i mięśniach myszy, które otrzymywały jednorazowo domięśniowo siarczan atropiny w celu zablokowania muskarynowych receptorów cholinergicznych, a po upływie 1 i 2 godzin dodatkowo podawano im podskórnie L-glutaminian sodu albo kwas N-metylo-D-asparaginowy. Zmiany aktywności AChE obserwowano również w warunkach wcześniejszego zablokowania nikotynowych receptorów cholinergicznych przez domięśniową iniekcję chlorku heksametoniowego, a po upływie 1 i 2 godzin dodatkowej podskórnej iniekcji L-glutaminianu sodu względnie kwasu N-metylo-D-asparaginowego. Ponadto po kompleksowym zablokowaniu muskarynowych i nikotynowych receptorów cholinergicznych przez równoczesne domięśniowe podanie myszom siarczanu atropiny i chlorku heksametoniowego, a po 1 i 2 godzinach dodatkowej podskórnej iniekcji L-glutaminianu sodu albo kwasu N-metylo-D-asparaginowego wykazano statystycznie istotne obniżenie aktywności AChE w mózgu i analizowanych mięśniach. W prezentowanej pracy przeprowadzono także eksperyment, który dotyczył wpływu omawianych już wcześniej agonistów i antagonistów receptorów glutaminianergicznych oraz antagonistów muskarynowych i nikotynowych receptorów cholinergicznych na okołodobową aktywność lokomotoryczną myszy w warunkach LD 12:12. Na podstawie przeprowadzonych badań stwierdzono, iż wszystkie zastosowane związki spowodowały wyraźne obniżenie okołodobowej średniej aktywności lokomotorycznej, a także znaczne obniżenie fourierowskiej amplitudy maksymalnej.